Nell’anno 2016 la ricerca dell’Unità di Varese in collaborazione con la Fondazione Matarelli si è concentrata sullo sviluppo di un database internazionale sulla mielofibrosi post-policitemia vera e post-trombocitemia essenziale. Il database ha incluso dati clinici, genetici e molecolari di 781 pazienti raccolti in 17 centri ematologici europei e americani. Inoltre sono state gettate le basi per lo sviluppo di un database web-based (RedCap) per lo studio delle neoplasie mieloidi che sarà diffuso a livello della Rete Ematologia Lombarda per la raccolta integrata di informazioni cliniche e molecolari di tali malattie a livello lombardo. Lo sviluppo di database corrisponde all’obiettivo n.1 del progetto.
L’obiettivo n.2 del programma di ricerca è quello di valutare la presenza di mutazioni driver e mutazioni addizionali in pazienti affetti da neoplasie mieloidi con tecnologia NGS (Next-Generation Sequencing). Questa tecnologia, che permette il sequenziamento di molti geni contemporaneamente e a costi inferiori rispetto all’approccio tradizionale (sequenziamento di Sanger), è stata scelta per identificare le varianti somatiche dei geni coinvolti nelle neoplasie mieloidi. Lo studio dell’assetto mutazionale di questi pazienti è necessario per ipotizzare i meccanismi molecolari alla base della patologia, per stratificare i pazienti in classi di rischio e per identificare una correlazione genotipo-fenotipo clinico.
Nel 2016 è stata svolta l’attività preparatoria allo sviluppo di NGS: collezione di materiale biologico; scelta e/o installazione delle strumentazioni e dei prodotti accessori necessari per effettuare la preparazione dei campioni e il sequenziamento.
Il sangue periferico dei pazienti con neoplasie mieloidi, tramite gradiente di densità con Ficoll, è stato separato lo stesso giorno del prelievo nelle diverse popolazioni cellulari; dalle cellule polimorfonucleate è stato estratto il DNA rappresentativo della patologia mentre dalla frazione di cellule mononucleate sono stati selezionati positivamente i linfociti T mediante biglie magnetiche coniugate con anticorpi anti-CD3 (Dynabeads CD3, Invitrogen). Il DNA estratto dai linfociti T è stato utilizzato come controllo costituzionale. Il confronto tra lo stato mutazionale del DNA somatico e di quello costituzionale permette l’identificazione delle varianti somatiche rilevanti per la malattia.
Per raggiungere l’obiettivo del programma di ricerca è stata necessaria una fase preparatoria che ha previsto la scelta e lo studio del pannello di geni adatto per l’analisi molecolare dei pazienti con neoplasie mieloidi, l’allestimento delle postazioni di lavoro per la preparazione del campione e il successivo sequenziamento, l’apprendimento dei metodi e della chimica del sequenziamento Illumina e della strumentazione MiniSeqTM System.
Per studiare l’assetto mutazionale dei pazienti con mielofibrosi, dopo aver valutato diversi pannelli commerciali, è stato scelto il pannello TruSight® Myeloid (Illumina) che comprende 54 geni più frequentemente mutati nelle neoplasie mieloidi. Questo è stato acquisito su fondi propri della Fondazione. In particolare il pannello copre le intere regioni esoniche di 15 geni e regioni hotspots di mutazione di altri 39 geni. Il pannello comprende anche i geni JAK2, MPL e CALR che sono attualmente studiati in ambito diagnostico mediante altre tecniche di biologia molecolare. Lo studio del protocollo TruSight® Myeloid ha permesso di valutare i punti critici che potrebbero insorgere durante la procedura e stilare una lista dei prodotti accessori necessari. Questo protocollo utilizza 50 ng di DNA non frammentato e genera una libreria di 568 ampliconi di ~ 250 bp. Per l’analisi NGS è necessaria la preparazione delle librerie di sequenziamento. Il workflow per la preparazione della libreria prevede l’ibridazione di più coppie di oligonucleotidi alle regioni da sequenziare, un processo di estensione e ligazione degli oligonucleotidi, l’amplificazione con PCR e incorporazione degli indici campione-specifici e la conversione a single strand della libreria. Le librerie vengono successivamente caricate sul MiniSeqTM System per la fase di sequenziamento. Anche il laboratorio è stato predisposto per l’introduzione di questa nuova tecnologia: sono state allestite aree dedicate per la preparazione del campione, la lavorazione e il successivo sequenziamento.
Nel 2016 è stato preparato il protocollo clinico retrospettico/prospettico osservazionale di ruxolitinib nelle mielofibrosi. Il protocollo in attesa di parere del Comitato Etico di Varese, sarà quindi diffuso agli altri centri lombardi di Ematologia.
